Kurz & knapp
Die Fluoreszenzmikroskopie macht Strukturen sichtbar, die unter Anregungslicht eigenes Licht anderer Farbe abstrahlen. Nur diese Signale erscheinen hell auf dunklem Grund; alles andere bleibt unsichtbar.
Inhalt
Die Fluoreszenzmikroskopie beobachtet nicht das Licht, das durch die Probe geht, sondern Licht, das die Probe selbst aussendet. Bestimmte Moleküle, sogenannte Fluorophore, nehmen Licht kurzer Wellenlänge auf und senden Licht größerer Wellenlänge aus. Dieser Farbwechsel heißt Stokes-Verschiebung.
So funktioniert der Strahlengang
Meist wird die Probe von oben beleuchtet (Epifluoreszenz). Herzstück ist ein Filterwürfel mit drei Teilen:
- Der Anregungsfilter lässt nur Licht der passenden Farbe auf die Probe, etwa Blau.
- Ein dichroitischer Strahlteiler reflektiert das Anregungslicht zur Probe und lässt das längerwellige Fluoreszenzlicht durch.
- Der Sperrfilter blockiert Reste des Anregungslichts, sodass nur das Fluoreszenzsignal ins okular gelangt.
Weil der Hintergrund dunkel bleibt, sieht man selbst wenige Moleküle. Eine klassische Lichtquelle ist die Quecksilberdampflampe, heute sind es meist LEDs oder Laser.
Woher kommt das Leuchten?
Entweder färbt man die Probe gezielt mit Fluoreszenzfarbstoffen oder Antikörpern, oder man nutzt Eigenfluoreszenz, etwa Chlorophyll, das rot leuchtet. Ein berühmtes Beispiel ist das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus einer Qualle. Es lässt sich in Zellen einbauen und markiert dort Proteine. Dafür gab es 2008 den Chemie-Nobelpreis an Shimomura, Chalfie und Tsien.
Rechenbeispiel: Farbwechsel
Der verbreitete Farbstoff Fluorescein wird mit blauem Licht um 490 Nanometer angeregt und leuchtet grün bei etwa 520 Nanometern. Der Sperrfilter muss also alles unter etwa 500 Nanometern abschneiden. Je weiter Anregung und Emission auseinanderliegen, desto sauberer lassen sich beide trennen. Mehrere Farbstoffe gleichzeitig nutzt man mit mehreren Filterwürfeln, etwa für Zellkern in Blau, Gerüst in Grün und Proteine in Rot.
Grenzen und Sicherheit
- Ausbleichen: Fluorophore verlieren bei Dauerbeleuchtung ihre Leuchtkraft.
- Phototoxizität: Intensives Licht schädigt lebende Zellen.
- UV-Licht: Schädlich für Augen und Haut. Nie ohne passende Filter hineinblicken.
Achtung: Fluoreszenzgeräte mit UV-Quelle sind kein Spielzeug. Für Kinder und Hobby sind sie ungeeignet.
Wo Fluoreszenz an Grenzen stößt
Das Auflösungsvermögen bleibt das eines Lichtmikroskops, ungefähr 200 Nanometer seitlich. Dicke Proben streuen und überstrahlen. Dafür nutzt die Forschung das konfokale Mikroskop, das Licht aus anderen Ebenen ausblendet. Außerdem erscheinen Fluoreszenzbilder immer als Intensitäten. Farben werden bei Mehrkanalaufnahmen oft nachträglich zugeordnet und sind deshalb kein Abbild der Natur.
Praxisbezug für Hobbyanwender
Echte Fluoreszenzmikroskope sind aufwendig und gehören in Labore. Wer neugierig ist, kann Chlorophyll in Pflanzenblättern oder fluoreszierende Mineralien unter blauem Licht im auflicht betrachten. Als Einstieg in die Beobachtung genügt aber ein gutes Hellfeldgerät, das Du in der Bestenliste der Lichtmikroskope findest.
Verwandte Begriffe
Häufige Fragen
Was ist der Unterschied zwischen Fluoreszenz und Hellfeld?
Im Hellfeld siehst Du das Licht, das durch die Probe geht. In der Fluoreszenz siehst Du nur das Licht, das ein Farbstoff nach Anregung selbst aussendet. Dadurch ist der Hintergrund schwarz und Signale heben sich stark ab.
Wozu dient der Filterwürfel?
Er trennt Anregungslicht und Fluoreszenzlicht. Ein Anregungsfilter wählt die Farbe, der Strahlteiler lenkt sie auf die Probe, der Sperrfilter lässt nur das Leuchten zum Auge.
Kann ich Fluoreszenz mit einem Hobbymikroskop sehen?
Nur sehr eingeschränkt. Es fehlen Filter und starke Anregung. Bastellösungen sind möglich, UV-Licht ist jedoch gefährlich für die Augen. Ein ordentliches Laborgerät ist die bessere Wahl.
Quellen
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